Topmusicanswers
Rozwiązywanie problemów z amplifikacją PCR i RT-PCR
| Problem | Możliwa przyczyna |
|---|---|
| Brak opasek na żelu | Czas przedłużenia był za krótki |
| Termocykler nie miał odpowiedniej temperatury | |
| Dodatkowe, niespecyficzne opaski na żelu | Startery hybrydyzowały z miejscem wtórnym na szablonie |
| Zanieczyszczenie DNA zostało wprowadzone do starterów lub buforów |
- Co powoduje niepowodzenie PCR?
- Jak rozwiązać problem z PCR??
- Co byś zrobił, gdyby amplifikacja próbki w reakcji PCR nie powiodła się??
- Co się stanie, gdy do PCR dodasz za dużo primera??
Co powoduje niepowodzenie PCR?
Zwykle pierwszą rzeczą, jaką robią naukowcy, jest obwinianie wadliwego enzymu lub odczynnika, gdy eksperyment się nie powiedzie, ale w przypadku PCR jest to mniej prawdopodobne, że będzie to przyczyną niepowodzenia. Częściej przyczyną są głębsze problemy wewnętrzne, takie jak projektowanie starterów, parametry termocyklera lub niespecyficzne wiązanie z innymi sekwencjami matrycy.
Jak rozwiązać problem z PCR??
Sprawdź zdolność do amplifikacji wybranych polimeraz DNA. Używaj polimeraz DNA specjalnie zaprojektowanych do długiego PCR. Wybierz polimerazy DNA o wysokiej procesywności, które mogą wzmacniać długie cele w krótszym czasie. Zmniejsz temperaturę wyżarzania i wydłużania, aby pomóc w wiązaniu podkładu i termostabilności enzymu.
Co byś zrobił, gdyby amplifikacja próbki w reakcji PCR nie powiodła się??
Jeśli reakcja amplifikacji nie powiedzie się i podejrzewasz, że matryca DNA jest zanieczyszczona inhibitorem, dodaj podejrzany preparat DNA do reakcji kontrolnej z parą matrycy DNA i starterów, która w przeszłości była dobrze amplifikowana .
Co się stanie, gdy do PCR dodasz za dużo primera??
Zastosowanie wyższych stężeń starterów może mieć następujące skutki: Jeżeli startery są zdolne do tworzenia dimerów, zwiększenie ich stężenia powoduje jedynie utworzenie starterów-dimerów i nie poprawia amplifikacji pożądanego produktu PCR.
