Topmusicanswers
Zamiast tego należy zoptymalizować warunki PCR; podczas dostosowywania warunków PCR należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:
- Zmniejsz ilość szablonu.
- Zwiększ temperaturę wyżarzania.
- Użyj reakcji PCR przy dotknięciu.
- Zmniejsz liczbę cykli PCR.
- Przeprojektuj podkłady.
- Użyj zagnieżdżonych starterów.
- Ponownie wzmocnij produkt!.
- Dlaczego mój PCR nie działa??
- Jak zoptymalizować warunki PCR??
- Co powoduje rozmazywanie w PCR?
- Skąd wiesz, czy PCR jest zanieczyszczony??
Dlaczego mój PCR nie działa??
Pominięcie tylko jednego składnika reakcji PCR, czy to polimerazy DNA, starterów, czy nawet matrycowego DNA, spowoduje nieudaną reakcję. Najprostszym rozwiązaniem jest powtórzenie reakcji. ... Jeśli po tym nadal nie ma produktu PCR, prawdopodobnie jest coś innego, co utrudnia twoją reakcję.
Jak zoptymalizować warunki PCR??
Warunki PCR
- Stosować wyższe temperatury denaturacji (e.g., 98°C w przeciwieństwie do 94°C lub 95°C), aby umożliwić całkowitą denaturację matrycy.
- Utrzymuj jak najkrótsze czasy wyżarzania szablonów bogatych w GC.
- Użyj podkładów o wyższej Tm (>68 ° C), ponieważ wyżarzanie może nastąpić w wyższej temperaturze.
Co powoduje rozmazywanie w PCR?
Zanieczyszczenie DNA, RNA w próbce DNA, wysokie stężenie DNA w reakcji PCR może powodować rozmazywanie. ... Rozmazywanie DNA zwykle wywoływane w roślinach ze względu na wysokie stężenie matrycowego DNA.
Skąd wiesz, czy PCR jest zanieczyszczony??
Aby sprawdzić roztwór pod kątem zanieczyszczenia, zmontuj reakcje kontroli ujemnej przy użyciu nowych odczynników, o których wiadomo, że nie są zanieczyszczone, i dodaj jeden z podejrzanych roztworów do każdej reakcji. Ta reakcja pokazuje amplifikowane produkty wskazujące na zanieczyszczenie, jest dowodem na to, że dodany roztwór był zanieczyszczony.
